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植物超氧陰離子染色液(NBT法)的使用方法

更新時(shí)間:2022-11-23      瀏覽次數(shù):16987

植物超氧陰離子染色液(NBT法)的使用方法


植物組織在脅迫環(huán)境條件下會(huì)產(chǎn)生多種活性氧(ROS),ROS活性非常大且極其不穩(wěn)定,因此ROS的檢測通常因其最終產(chǎn)物而定。超氧陰離子是活性氧的一種,屬于一種含氧自由基,能將NBT(氮藍(lán)四唑)還原成不溶于水的藍(lán)色甲瓚化合物,從而定位組織中的超氧陰離子。根據(jù)基本原理也稱其為NBT法。本產(chǎn)品就是基于以上原理,用于植物活組織中的超氧陰離子染色。一般應(yīng)用于較嫩的根尖、葉片等的整體染色,染色后有超氧陰離子聚集的部位呈藍(lán)色至深藍(lán)色。


使用方法

1. 試劑準(zhǔn)備:將50 mg NBT以Tris緩沖液(pH 7.4) 100 mL充分溶解,得到NBT染色工作液,避光4℃保存,一周內(nèi)有效。

2. 采集植物幼苗或根尖,純水稍洗凈,濾紙上吸干多余水分。將植物幼苗或根尖浸入NBT染色工作液中,常溫避光浸染2-6 h,至陽性部位出現(xiàn)深藍(lán)色,其余部位為淡藍(lán)色或近無色或呈植物本身的顏色即可(根據(jù)植物幼嫩程度。顯色程度調(diào)整染色時(shí)間)。

3. 用鑷子將植物幼苗或者葉片小心取出,純水漂洗3-5次,置于濾紙上吸干多余水分后,浸入95%乙醇中40℃處理3-16 h,目的是脫去植株幼苗或者葉片本身的葉綠素或者淡藍(lán)色背景,處理期間可多次更換新鮮的95%乙醇。

4. 用鑷子取出植株幼苗或者葉片,浸入純水中來回漂洗3-5次,置于濾紙上吸干多余水分后,將樣本轉(zhuǎn)入適量NBT樣本保存液中浸泡30 min后,隨后可取出拍照。樣本可置于該溶液中常溫保存一周。


注意事項(xiàng)

1. NBT染色工作液配制好以后需4℃避光保存,一周內(nèi)使用。存放時(shí)間過久,會(huì)影響顯色。

2. 因任何外在因素都可能刺激植物應(yīng)激產(chǎn)生超氧陰離子,因此植物樣本需要新鮮采集,并盡快完成染色。建議做陰性及陽性空白對(duì)照組。

3. 樣本染色完成后盡快拍照保存結(jié)果。

4. 操作時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服,并佩戴一次性手套。


植物超氧陰離子染色液(NBT法)的使用方法


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