鈷瓊脂糖凝膠

英文名稱：Co-Berpharose FF-NTA

貨號(hào)：B2779

1.      產(chǎn)品介紹

鈷-瓊脂糖凝膠FF(NTA)以瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì)，活化偶聯(lián)次氮基三乙酸（NTA），之后螯合Co2+。鈷 NTA 瓊脂糖凝膠 FF 具特異性好，螯合鈷更穩(wěn)定，不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好。

鈷-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化含有組-氨酸標(biāo)簽（His-Tag）的重組蛋白。組-氨酸標(biāo)簽中的咪唑環(huán)同過渡金屬Ni2+形成穩(wěn)定的配位鍵，能特異、牢固和可逆地吸附在固定有Co2+的基質(zhì)上，可通過增加咪唑濃度對(duì)重組蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫。

2.規(guī)格

1ml（預(yù)裝柱）、5ml（預(yù)裝柱）、10ml（預(yù)裝柱）、20ml、100ml、500ml

（3）常用緩沖液有10-100 mM磷酸鈉緩沖液、20-200 mM Tris-HCl緩沖液等。

（4）緩沖液中一般要加入0.15-0.5 M的NaCl以消除離子交換作用。

（5）初次使用鈷-瓊脂糖凝膠FF時(shí)，推薦使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4）作為初始緩沖液。

③洗脫

（1）增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是鈷-瓊脂糖凝膠FF最-常-用的洗脫方法。

（2）咪唑?yàn)閴A性，相應(yīng)緩沖液配制后需要用HCl調(diào)節(jié)pH值。

（3）初次使用鈷-瓊脂糖凝膠FF時(shí)，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，濃度從低

到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。

（4）有條件的可以進(jìn)行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。

洗脫方法：

（1）降低pH洗脫：大多數(shù)蛋白在pH4-6會(huì)被洗脫下來（也可以在pH 3~4），緩沖液可以是醋狻鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。

（2）競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的濃度（如0-0.5M咪唑、0-50 mM組-氨酸、0-2M NH4Cl）。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH值下進(jìn)行。

（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產(chǎn)生作用力，導(dǎo)致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白，還會(huì)影響蛋白的吸附，導(dǎo)致融合蛋白無法掛柱。

注：降低pH洗脫和螯合劑洗脫會(huì)使得金屬離子脫落，下次使用前需要重新螯和金屬離子。最-常-用的方法為競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。

上述洗脫方法，均須在緩沖液中加入150 -500mM的NaCl以消除離子交換作用。

5.再生、清洗、保存

①凝膠再生

（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時(shí)，必須將凝膠脫鈷再生。脫鈷方法：用5-10個(gè)柱體積的蒸餾水淋洗柱子，再用5-10個(gè)柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子，最后用2-3個(gè)柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鈷后一般需要進(jìn)行清洗。清洗方法：用0.1-1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1-2 h，能去除結(jié)合強(qiáng)的雜質(zhì)，同時(shí)也能去除熱源。

（3）清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：用2-5個(gè)柱體積的蒸餾水充分平衡脫鈷后的柱子，用0.1-0.3 M金屬鹽溶液過柱5-10個(gè)柱體積以螯合金屬離子，之后用5-10個(gè)柱體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。

②在位清洗

（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：使用1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為10-15 分鐘清洗，然后，再使用去離子水清洗10 個(gè)柱體積。

（2）去除強(qiáng)疏水性蛋白和脂質(zhì)等：通過使用30%異丙純清洗5-10 個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為15-20 分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料2 倍柱體積。例如，含有0.1–0.5%  非離子去污劑的0.1 M  醋狻溶液，接觸時(shí)間 為1–2  小時(shí)。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗5 個(gè)柱體積，以徹-底去除去污劑。 最后使用10 倍柱體積的去離子水清洗。

（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟。

6.注意事項(xiàng)：

1)使用時(shí)保證柱子和緩沖液的溫度一致，避免柱床內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響純化效果。

2)本產(chǎn)品保存條件為20%乙醇，4-8℃。

3) 2-25℃,常壓,避光運(yùn)輸

4）僅供科研實(shí)驗(yàn)使用

鈷瓊脂糖凝膠